Resumo Biópsias de melanoma primário, incluídas em parafina após fixação em formol, foram estudadas para pesquisa de perdas no braço curto do cromossoma 9, utilizando-se reação em cadeia da polimerase (PCR) micro-satélite para os loci D9s157, D9s161 e D9s 171. O DNA pareado, normal e neoplásico foi extraído do mesmo bloco para comparação dos padrões micro-satélites de marcação. Alguma anormalidade detectável foi vista em pelo menos um destes loci em 14 dos 44 espécimes que se mostraram próprios para análise (34%). Deleções homozigoticas foram detectáveis nestes loci em 8 dos 44 espécimes (18%) e deleções hemizigoticas foram vistas em 11 dos 44 espécimes (25%). As deleções foram mais comumente encontradas à medida que a espessura neoplásica aumentava (p<0,05). Estes achados permitem concluir que as deleções na região 21 do braço curto do cromossoma 9 estão presentes nos melanomas primários não familiais e que elas não representam apenas um fenômeno in vitro.

Introdução Deleções na região p 21 (braço curto) do cromossoma 9 ocorrem freqüentemente em muitos tumores humanos, particularmente gliomas, leucemias linfóides, linfomas(2-4), tumores da cabeça e pescoço(5,6), carcinoma esofágico(7,8), adenocarcinoma pancreático(7,9), tumores vesicais(10,11), cânceres pulmonares(2, 12-14), sarcomas, mesoteliomas (15,16) e melanomas(2, 17-19). Um estudo pan-genomico recente no melanoma mostrou que os defeitos no locus 9p21 representavam as deleções cromossômicas mais comuns nestes tumores (18). Para melhor definir a extensão e freqüência das deleções do braço curto do cromossoma 9 em melanomas primários, biópsias de melanomas foram examinadas em busca de heterozigoticidade em 3 loci do 9p21 através de testes micro-satélites de PCR. Métodos Foram cortados, em média, 3 secções dos blocos preparados em parafina (40 micrômetros) num micrótomo de UV, utilizando-se lâminas descartáveis.O microtomo foi exposto a UVC por 15 a 30 minutos antes do uso. Seguia-se então cuidadosa microdissecção dos cortes para separar o tumor dos tecidos normais. Apenas áreas claramente identificadas como tecido normal ou tumoral foram usadas para a extração do DNA. As áreas microdissecadas foram então desparafinizadas e digeridas com proteinase K por 48 a 72 horas obedecendo a tecnica descrita por Wright e Manos (20). Apos inativação calórica da proteinase K, a fase aquosa resultante foi usada com alvo para o PCR. Ensaios microsatélites usaram elementos básicos para os loci D9S157, D9S161e D9S171 provenientes do Research Genetics, Inc. (Huntsville, AL). Estes marcadores foram empiricamente escolhidos por sua robustez em especimens de DNA fixados em formalina. As condições de PCR foram estabelecidas para uma melhor visualização UV dos produtos básicos em geis de agarose a 2orados com brometo de etidio (NuSieve 3:1). As reações foram realizadas em um ciclador térmico modelo 480 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) utilizando -se um protocolo de 35 ciclos com 0.2 mM dNTPs, 50 mM KCl, 0.5 µCi de 33P-dATP, e 1.25 unidades de Taq DNA polimerase em um volume de 20 µl (concentracoes finais). MgCl2 e as concentracoes dos elementos básicos para os tres ensaios foram 2 mM e 1.0 µM para o ensaio com o D9S157 e 1,5 µM para o ensaio do D9S161 , e 2 mM e 0,5 µM para o ensaio com D9S171. Ensaios de PCR comparativos para amostras tumorais pareadas e amostras normais foram feitos simultaneamente. Os produtos de PCR das reações pareadas normais e reações tumorais foram processados em depósitos adjacentes de gel de poliacrilamide não desnaturizante a 15% E, 650 V e processados em imagem com autoradiografia. Avaliações visuais das intensidades de bandas autoradiografadas foram confirmadas e quantificadas na maioria dos casos com densitometria, usando uma imagem escaneada de forma convencional e um software analizador de imagens (NIH Image 1.58). Casos duvidosos ou aqueles com intensidades de bandas saturadas à autoradiografia foram avaliadas diretamente do gel usando um "Phosphoroimager" (PhosphorImager SI, Molecular Dynamics, Inc.). A extração do DNA se fez por desparafinização, digestão pela proteinase, inativação pelo calor e a fração aquosa foi usada como substratos para a PCR, com marcadores para os loci D9s157,D9s161 e D9s171. As intensidades das bandas dos alelos normais foram empregadas como valores basais (controle) comparativos. A perda de um alelo hemizigoto foi considerada presente no tumor quando havia redução de pelo menos 50a intensidade expectada da banda em, pelo menos; duas áreas de deslocamento da PCR.

Figura 1: Exemplos de perdas homozigoticas D9S157 nos especimens 59 e 60. Em ambos os casos, a banda alélica superior (seta) está diminuída nas amostras tumorais (T59 e T60) relativo à intensidade esperada acima de 50omparada as bandas normais que serviam de amostras (N59 e N60).

A perda de um alelo homozigoto era contabilizada quando os alelos neoplásicos estavam repetidas vezes ausentes, ou diminuídos, em relação à expectativa desejada, em pelo menos 90%, enquanto que as reações simultâneas de controle da mesma amostra mostravam bandas fortes. Reacoes de controle em loci cromossomicos nao envolvidos incluindo D3S1038 e D18S44 (nao frequentemente envolvidos em relatos de anormalidades cariotipicas e genomicas no melanoma), foram realizadas simultaneamente com ensaios repetidos para o 9p21 com o objetivo de eliminar artefatos tecnicos. Resultados Laminas microscopicas de aproximadamente 200 a 300 biopsias foram analizadas tendo em vista uma combinacao de areas bem delimitadas contendo amostras tumorais e quantidades adequadas de tecidos normais. Aproximadamente 75 destas biopsias foram inicialmente extraidas e analizadas para adequacao-alvo usando controles basicos para carbonil redutase de exon 3 (NADP3) trabalhadas para fornecer um produto de 194 bp. 52 dentro de um total de 75 apresentaram sinal bastante forte tanto em extratos de DNA de tecido normal como de tecido tumoral a ponto de garantir avaliacao posterior. Informacao disponivel e plausivel de pelo menos um dos tres loci foi encontrada em 44 destas 52 biopsias e tais informacoes foram usadas para gerar a Figura 2. Figura 2: Informacoes a respeito de perda alelica para 44 melanomas primarios. O braco curto do cromossoma 9 e as posicoes relativas para os marcadores D9S157, D9S171 e D9S161 encontram-se demonstrados no lado esquerdo da figura. Os numeros dos especimens acham-se indicados acima da demonstracao ideogramatica dos status dos marcadores. O exposto sumariza os resultados obtidos nestes especimens com os ensaios envolvendo D9S157, D9S161 e D9S171. Dos 44 especimens em analize, 15/44 (34%) mostravam delecoes detectaveis ( ambas hemizigoticas e homoziticas), 8/44 (18%) possuiam delecoes homozigoticas e 11/44 (25%) tinham delecoes hemizigoticas. Figura 3: Posicoes relativas dos marcadores do cromosomo 9 . Uma estimativa da distancia do final do braco curto em megabases e' fornecida a direita ( Fonte: The Genome Database, Johns Hopkins University School of Medicine, 1996). A Figura 3 sumariza estimativas correntes da localizacao genomica dos marcadores relevantes em 9p. Tabela 1. Informacao sobre a espessura segundo o indice de Breslow Espessura (mm) Numero de casos Porcentagem <0.75 1 3 0.75-1.49 4 11 1.5-3.99 13 36 >4.0 18 50 36 100 A Tabela 1 mostra a espessura de tumor primario relativa a 36 biopsias para as quais esta informacao estava disponivel. Como podemos ver imediatamente a partir da Tabela 1, as amostras neste estudo mostraram um bias em relacao as lesoes mais espessas. Isto tornou-se necessario devido a exigencia fisica para areas adequadas e bem individualizadas distinguindo regioes de tecido sadio e tecido tumoral numa mesma biopsia. Quando a espessura media de tumores com delecoes de 9p21 nos tres loci examinados foram comparadas com aquelas que nao tinham delecoes detectaveis, a espessura media mostrou ser maior em tumores com delecoes que a espessura media de tumores sem as delecoes do 9p21 (p < 0,05). Conclusões A região 9p21 foi identificada como o local de , pelo menos, dois gens considerados supressores de tumores, o CDKN2A (p16), e o CDKN2B (p15). Estes são gens inibidores das cinases, que inibem passos do ciclo celular (21-24). Kamb et. Al a princípio relatou que o MTS1 ( que dá acesso à leitura de moldura do CDKN2A) havia sofrido deleção ou mutação em 75% de 99 linhas celulares de melanomas (23). Foi relatado que células tumorais cultivadas exibem maior freqüência de deleções das regiões 9p21 que tumores primários, provavelmente porque estas deleções conferem uma vantagem ao crescimento destas células in vitro (6, 25). Este fato levou à interpretação de que a deleção do CDKN2A possa ser, principalmente um fenômeno in vitro, implicando num papel menor na biologia tumoral in vivo e que o CDKN2A não estaria de fato envolvido verdadeiramente no desenvolvimento do melanoma. Evidência mais recente sugere que o CDKN2A está, de fato, envolvido no desenvolvimento do melanoma. Forte evidência de que o CDKN2A seja um supressor do melanoma deriva do fato de que este é um gen tumoral familial (21). Evidência indireta adicional é derivada da demonstração de mutações no CDKN2A em linhas celulares de melanoma, consistente com aquelas induzidas pela luz ultravioleta (26). Até agora, a mais forte evidência disponível para implicar este gen no desenvolvimento do melanoma é a expressão do CDKN2A em material de tumor primário, conforme demonstrado à imuno-histoquímica (27). Este estudo confirma a relação entre espessura tumoral e deleções dos 9p21 observadas por outros autores (17,27) e sugere que as deleções das 9p21 mais freqüentemente se desenvolvam durante a progressão do tumor. Contudo, lesões incipientes mostram evidência de anormalidades dos 9p21, implicando que estas possam ocorrer nas fases evolutivas iniciais do tumor. Nós encontramos evidências de deleção das 9p21 em duas de 11 lesões incipientes (Breslow inferior a 1,5mm). Este estudo confirma a relação entre espessura tumoral e deleções dos 9p21 observadas por outros autores (17,27) e sugere que as deleções das 9p21 mais freqüentemente se desenvolvam durante a progressão do tumor. Contudo, lesões incipientes mostram evidência de anormalidades dos 9p21, implicando que estas possam ocorrer nas fases evolutivas iniciais do tumor. Nós encontramos evidências de deleção das 9p21 em duas de 11 lesões incipientes (Breslow inferior a 1,5mm). Healy et. al encontrou estas alterações com 3/9 deleções no locus 9p21 em tumores primários medindo menos de 1,5 mm de espessura (18). Isto não é surpreendente uma vez que , pelo menos um gen 9p21 (ex: CDKN2A) é sabidamente um gen do melanoma, implicando que ele possa ser a primeira anormalidade genética num tumor (21,28). Este estudo revela evidências de deleção em 43 0os casos próprios para análise, cifra esta similar ou discretamente inferior a outros relatos recentes de perda de heterozigoticidade neste locus em melanomas (19, 29,30). Estes estudos podem, contudo, estar, na verdade, subestimando anormalidades dos gens 9p21 por várias razões, desde que este é um estudo de lesões primárias e a inativação dos p16 possa aumentar em freqüência à medida que o melanoma progride de primário para metastático (27). Os dados em material de parafina oferecem dificuldades de interpretação e certos loci que foram excluídos da análise poderiam, na verdade, representar as deleções. Pequenas deleções homozigoticas, as quais se sabe, ocorrem nesta região(2,31,32) poderiam não ser, necessariamente detectadas nesta metodologia.. Estudos que marcam cromossomas não irão revelar exemplos de pontos de mutação bilateral em gens de supressão tumoral associados. Não foi possível obter dados de seqüência suficientemente seguros destes espécimes fixados em formol para estabelecer qualquer posição de freqüência de mutações do CDKN2A nestes espécimes. Finalmente, esta abordagem não tem valor na detecção de anormalidades ao nível das interações protéicas ou expressão protéica como, por exemplo, a metilação das seqüências do facilitador, uma anormalidade que se conhece ocorrer com ambos, o CDKN2A e o CDKN2B (33, 34). Os dados obtidos neste estudo com marcadores confirma que os melanomas esporádicos (não familiais) exibem uma substanciosa freqüência de anormalidades no braço curto do cromossoma 9. O presente estudo, junto a outros relatos de freqüente deleção da região 9p21 no material tumoral provê forte evidência de que um gen ou gens neste locus podem estar vinculados ao melanoma esporádico, assim como ao familial. Enquanto esta evidência não prova que CDKN2A ou CDKN2B são agentes supressores tumorais causativos em melanomas esporádicos, estas informações são consistentes com o aludido conceito. Agradecimentos:Os autores agradecem o Oklahoma Center for the Advancement of Science and Technology pelo apoio a este trabalho, o Molecular Biology Resource Core Laboratory em Oklahoma City e o Oklahoma Center for Molecular Medicine (OCMM) Computer Facility em Norman, cujas fontes foram utilizadas para a consecução deste trabalho. Referencias 1. Moulton T, Samara G, Chung WY, et al.: MTS1/p16/CDKN2 lesions in primary glioblastoma multiforme. Am J Pathol 146(3):613-619, 1995. 2. Coleman A, Fountain JW, Nobori T, et al.: Distinct deletions of chromosome 9p associated with melanoma versus glioma, lung cancer, leukemia. Cancer Res 54(2):344-348, 1994. 3. Ogawa S, Hirano N, Sato N, et al.: Homozygous loss of the cyclin-dependent kinase 4-inhibitor (p16) gene in human leukemias. Blood 84(8):2431-2435, 1994. 4. Duro D, Flexor MA, Bernard O, et al.: Alterations of the putative tumor suppressor gene p16/MTS1 in human hematological malignancies. 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